La técnica molecular ayuda a la investigación

Con el conocimiento de los avances en la diferenciación de las especies de  Guignardia presentes en cítricos, publicados en 2003, se comenzó a ajustar la técnica molecular en la Sección Fitopatología de la EEAOC. En primer lugar se realizó la extracción de ADN a partir de colonias puras del  hongo. Luego comenzó a aplicarse la técnica de diferenciación mediante  PCR. Si bien las primeras pruebas de diferenciación se realizaron con  cepas de Guignardia obtenidas de “moteado”, síntoma al cual estaba  dirigida en ese momento la investigación en el marco del convenio  Afinoa-EEAOC, se incluyeron tres cepas aisladas de las citadas “manchas  rojizas”.
Los primeros resultados indicaron que dos de ellas, las cuales habían sido aisladas de frutos con presencia únicamente de manchas rojizas, correspondieron a Guignardia mangiferae, mientras que la tercer cepa correspondió a Guignardia citricarpa, habiendo sido esta última aislada de síntoma de mancha rojiza, pero de un fruto de limonero con presencia también del síntoma de mancha típica de la “mancha negra” de los cítricos.
Ante estos resultados, se intensificó la investigación hacia los síntomas rojizos y se planteó el objetivo de determinar si las manchas rojizas presentes en limoneros de Tucumán, en lotes donde no se observan los síntomas típicos de mancha negra de los cítricos con picnidios, correspondían al síntoma “mancha  pecosa” de la mancha negra causada por Guignardia citricarpa.
Es así que se aumentó el número de siembras, alcanzando las 1.608  siembras. De ellas se obtuvieron 79 cepas puras mediante la realización de cultivos monospóricos. Los organismos detectados fueron los mismos que en  las primeras siembras realizadas: Guignardia sp., Colletotrichum sp. y saprofitos.
Se realizó la diferenciación molecular de todas las cepas obtenidas, utilizando siempre como testigo cepas aisladas de síntomas típicos de mancha negra de los cítricos.
Para las pruebas moleculares, se extrajo ADN de las colonias cultivadas en APG y, además, se extrajo ADN directamente de frutos con síntomas de mancha rojiza mediante el kit de extracción DNeasy.
 Los resultados indicaron que la totalidad de las 79 cepas aisladas de manchas rojizas correspondieron a Guignardia mangiferae (Phyllosticta capitalensis). El ADN de las cepas testigo correspondió a Guignardia citricarpa (Phyllosticta citricarpa). Asimismo, el ADN extraído directamente de cáscara de limón con síntomas de mancha rojiza (sin previo aislamiento del hongo en APG) correspondió a Guignardia mangiferae (Phyllosticta capitalensis).
Las 79 cepas evaluadas fueron cultivadas en agar harina de avena, comparando sus características (velocidad de crecimiento y presencia de pigmentación amarilla) con las cepas testigos. Los resultados coincidieron con la diferenciación molecular. Las 79 cepas obtenidas de mancha rojiza correspondieron a Guignardia mangiferae (Phyllosticta capitalensis), por la ausencia de pigmentación amarilla y el crecimiento rápido. En cambio, las cepas aisladas de mancha típica con picnidios (testigo) correspondieron a Guignardia citricarpa, por la presencia de pigmentación amarilla en los bordes de las colonias y un crecimiento lento